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Técnica para a determinação de anticorpos anti-toxóide tetânico:

1) Toxóide Tetânico: Anatoxina Tetânica (Lote IB-10/99) produzida no Instituto Butantan- São Paulo

2) Conjugado anti-IgG humano marcado com peroxidase (Sigma A-0170)(Fc specific, produzido em cabra)

3) Tetanogamma (Imunoglobulina Antitetanica). 1 ampola de 1ml com 250 UI. Centeon

4) Tampão PBS:
NaH2PO4H2O (fosfato de sódio monobásico) - 0,346g
Na2HPO4 (fosfato de sódio dibásico anidro) - 1,06g
NaCl (Cloreto de sódio) - 8,5g
q.s.p 1 litro de água destilada
pH=7,4

5) Tampão citrato-fosfato:
Ácido cítrico - 7,4g
Fosfato de sódio dibásico anidro - 9,94g
q.s.p 1 litro de água
pH=5,0

6) Ácido Sulfúrico 2,5N:
Água destilada - 402 ml
H2SO4(ácido sulfúrico) - 30 ml

 

1) Adsorver o antígeno na placa (Costar) numa concentração final de 10 ug/ml em tampão carbonato-bicarbonato de sódio (100ul por poço).

3) Incubar as placas a 4oC "overnight".

4) Lavar as placas com PBS-Tween 0,1%.

5) Bloquear as placas com leite molico 5% em PBS-Tween 0,05% por 1 hora a 37oC ( 100 ul por poço)

6) Lavar novamente as placas.

7) Diluir as amostras em leite molico 1% em PBS-Tween 0,05%.

8) Incubar por 1 hora a 37oC (100 ul por poço).

9) Repetir o procedimento de lavagem.

10) Adicionar o conjugado anti-IgG humano marcado com peroxidase diluído no mesmo tampão das amostras (100 ul por poço).

11) Incubar por 1 hora a 37oC.

12) Repetir o procedimento de lavagem.

13) Adicionar o substrato da enzima (100 ul por poço).

14) Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos (escuro).

15) Bloquear a reação com Ácido Sulfúrico 2,5N (50 ul por poço).

16) Leitura em comprimento de onda de 492nm

Soluções:
Solução A: Carbonato de sódio: 10,6 g de Na2CO3 em 500 ml de água destilada
Solução B: Bicarbonato de sódio: 8,4 g de NaHCO3 em 500 ml de água destilada
Para a placa:
0,72 ml da sol. A
2,04 ml da sol. B
8,25 ml de água destilada

Substrato:
25 ml de tampão citrato-fosfato 0,1 M pH 5,0
1 pastilha de OPD (10 mg)
10 ul de H2O2

Para a construção da curva padrão:
Tetanogama (Imunoglobulina antitetânica) 250UI (no ensaio começamos com uma diluição de 1/5000)

 
 
 
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